在生命科學(xué)研究和生物制藥領(lǐng)域，蛋白質(zhì)的高效純化是獲取高純度、高活性目標(biāo)蛋白的關(guān)鍵步驟。柱層析技術(shù)作為蛋白純化的核心手段，憑借其操作簡(jiǎn)便、分離效率高、可規(guī)模化放大等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室研究和工業(yè)生產(chǎn)中。根據(jù)分離原理的不同，蛋白純化柱層析主要可分為離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、親和層析和疏水相互作用層析四種主流方法，每種方法都有其原理、操作要點(diǎn)和適用場(chǎng)景。

 

 

　　離子交換層析是基于蛋白質(zhì)表面電荷與層析介質(zhì)上帶電基團(tuán)之間的靜電相互作用實(shí)現(xiàn)分離的技術(shù)。在特定的 pH 環(huán)境中，蛋白質(zhì)會(huì)攜帶不同性質(zhì)和數(shù)量的電荷，當(dāng)樣品溶液流經(jīng)填充有離子交換樹(shù)脂的層析柱時(shí)，帶相反電荷的蛋白質(zhì)會(huì)與樹(shù)脂表面的功能基團(tuán)結(jié)合，而不帶電荷或電荷相同的蛋白質(zhì)則直接流出。通過(guò)改變洗脫液的離子強(qiáng)度或 pH 值，可使結(jié)合在樹(shù)脂上的蛋白質(zhì)按照親和力從弱到強(qiáng)的順序依次洗脫下來(lái)，從而達(dá)到分離純化的目的。該方法對(duì)蛋白質(zhì)的分辨率較高，尤其適用于分離等電點(diǎn)差異明顯的蛋白質(zhì)混合物，在重組蛋白的初步純化階段應(yīng)用廣泛。
 

　　凝膠過(guò)濾層析，又稱分子篩層析，其分離原理基于蛋白質(zhì)分子的大小差異。層析柱內(nèi)填充的凝膠顆粒具有均勻的多孔結(jié)構(gòu)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物流經(jīng)層析柱時(shí)，小分子蛋白質(zhì)能夠進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的孔隙中，流經(jīng)路徑較長(zhǎng)，保留時(shí)間較長(zhǎng)；而大分子蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入孔隙，只能沿著凝膠顆粒之間的間隙流動(dòng)，流經(jīng)路徑較短，先被洗脫出來(lái)。這種按分子大小進(jìn)行分離的方式具有條件溫和、不改變蛋白質(zhì)活性的優(yōu)點(diǎn)，常用于蛋白質(zhì)的脫鹽、分子量測(cè)定以及去除樣品中的小分子雜質(zhì)。在蛋白純化的后期階段，凝膠過(guò)濾層析常被用于進(jìn)一步純化和調(diào)整蛋白溶液的緩沖體系。
 

　　親和層析是一種利用生物分子間特異性相互作用進(jìn)行分離的高效方法，其核心在于層析介質(zhì)上固定的配體與目標(biāo)蛋白之間的專一性結(jié)合。例如，抗原與抗體、酶與底物、生物素與鏈霉親和素等都可作為親和配對(duì)系統(tǒng)。當(dāng)樣品溶液通過(guò)層析柱時(shí)，目標(biāo)蛋白會(huì)與配體特異性結(jié)合而被保留在柱上，其他雜蛋白則隨流動(dòng)相流出；之后通過(guò)改變洗脫條件(如加入競(jìng)爭(zhēng)性配體或調(diào)整 pH 值)，可將目標(biāo)蛋白從柱上洗脫下來(lái)。親和層析具有高的選擇性和純化效率，一步純化即可達(dá)到很高的純度，是純化帶有標(biāo)簽的重組蛋白的方法。
 

　　疏水相互作用層析基于蛋白質(zhì)表面的疏水基團(tuán)與層析介質(zhì)上的疏水配體之間的疏水相互作用實(shí)現(xiàn)分離。在高離子強(qiáng)度的溶液中，蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域會(huì)暴露出來(lái)，與疏水介質(zhì)結(jié)合；隨著洗脫液離子強(qiáng)度的降低，疏水相互作用減弱，蛋白質(zhì)按照疏水性從弱到強(qiáng)的順序被洗脫。該方法適用于分離疏水性差異較大的蛋白質(zhì)，常與離子交換層析配合使用，在蛋白純化的中間階段去除大量雜蛋白。